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Sto effettuando prove di Ring Test: mi è stato inviato un campione di carne liofilizzata ed io l'ho conservato in frigorifero, per poi tenerlo a temperatura ambiente per 60 minuti; quindi processarlo con un omogeneizzatore da laboratorio (stomacher) ed effettuare l'inoculo in piastra.
Alla lettura dei risultati, soprattutto per le piastre della Carica Batterica Totale (CBT), mi trovo poche colonie di forma circolare con un alone intorno molto marcato (fig. 1).
(fig. 1 - Colonie Microbiche di forma circolare e circondate da alone scuro)
Le colonie circolari sono in rilievo e sono quindi Unità Formanti Colonia (UFC), mentre gli aloni sembrerebbero batteri ma non lo sono.
Faccio bene a non contarli?
Help me!
Oggetto: Ring Test (conta su piastra): conteggiare aloni colonie?
io rispondo sulla base della mia esperienza nel campo delle analisi microbiologiche. Le difficoltà nel determinare il numero preciso delle colonie possono essere dovute a due ragioni:
il campione non è stato sufficientemente diluito e pertanto vi è una eccessiva densità batterica che rende difficile la conta della carica batterica del campione;
il campione non è stato appropriamente seminato in quanto le colonie sono concentrate in una sola area della piastra.
Al fine di rendere la colonia contabile io proverei ad effettuare un numero maggiore di diluizioni decimali, onde ottenere una densità tale da poter effettuare agevolmente la conta delle colonie.
Per stabilire se siano o meno batteri, invece, si possono predisporre vetrini da esaminare al microscopio, onde verificare che non abbiano una conformazione diversa dai batteri. Per identificare la specie, infine, si può ricorrere a terreni colturali selettivi. In alternativa si possono utilizzare metodi di estrazione del DNA e metodi Polymerase Chain Reaction (PCR) per l'identificazione della specie.
Nel caso avessi bisogno di altre informazioni, per contattarmi puoi ricorrere al tasto email (quello raffigutante una busta) che trovi sotto questa mia dichiarazione.
Sono d'accordo su quanto riferisce mmassa; posso comunque aggiungere che:
la piastra è stata messa probabilmente in incubatore troppo presto, senza lasciarla sotto cappa qualche minuto (almeno il tempo per lasciar asciugare il film d'acqua in eccesso), questo potrebbe aver portato ad una migrazione di colonie.
Possibile soluzione: migliorare l'omogeneizzazione con lo stomaker (non superando i 3 minuti), operare una diluizione scalare almeno fino a -6 e, una volta distribuito l'inoculo, lasciare qualche minuto sotto cappa con coperchio leggermente aperto.
In questo modo, l'amico tannico dovrebbe risolvere.
Non posso procedere oltre per capire se siano batteri o meno
Lavoro in un laboratorio aziendale e le strumentazioni sono limitate.
Comunque uso un substrato per CTB mesofila aerobia con incubatore a 30°C e raramente ci cresce qualcosa che non siano batteri, qualche muffa ma nulla più.
Ho effettuato le seguenti diluizioni1:10; 1:100 (la piastra in foto è 1:100); 1:1000; 1:10000; 1:100000; 1:1000000.
Il Ring Test è un confronto intralaboratoriale per il Programma VEQ (Valutazione Esterna di Qualità); a tal scopo mi hanno spedito il campione di 10g di carne liofilizzata a carica batterica nota che io devo misurare.
I miei possibili errori potrebbero essere stati:
su consiglio del mio capo, ho diviso ulteriormente il campione di 10g in due campioni da 5 g (mentre è sconsigliata questa modalità);
il campione da 10 g andava tenuto a temperatura ambiente; mentre nel mio laboratorio (che si trova accanto ad una cella frigorifero) la temperatura non è vicina a quella ambientale;
ho effettuato una precoce sistemazione in incubatore.
Potrebbe spiegarmi perchè dovrei lasciare il coperchio aperto prima di incubare? La trovo una pratica empirica interessante.
Inoltre, avrei un'altra domanda: l'omogeneizzato dello stomacher l'ho conservato in frigorifero nella sua busta chiusa con scotch. Dopo alcuni giorni ho ripiastrato e la crescita è stata soddisfacente... Posso, secondo lei, considerare reale la carica batterica cresciuta dopo questa operazione?
Lasciare il coperchio leggermente scostato serve ad eliminare l'umidità in eccesso e limitare il percorso di possibili colonie striscianti. Ricordiamo che il terreno deve essere ben asciutto prima di porvi l'inoculo.
Non bisogna separare il liofilizzato per un semplice calcolo probabilistico: se io divido a metà esattamente 5,00000000 grammi non è detto che la carica batterica sia distribuita esattamente al 50%. Il tuo capo ritiene che la microbiologia sia come una quadriglia: con gli uomini schierati da una parte e le donne dall'altra... Questi test costano, ma vanno comunque affrontati correttamente.
Relativamente alla possibilità di riutilizzare l'omogenato: bella domanda; un consiglio è di tenere l'omogenato a temperatura prossima allo zero (senza però arrivare a congelare!) e ripetere, non oltre le 12 ore, per una verifica in doppio con stesso operatore o operatore diverso.
Chiaramente trattasi di pratiche non lecite, ma che comunque possono darci o non darci (sconforto) risultati sovrapponibili.
I liofilizzati, per quanto ricordi, vanno tenuti a temperatura ambiente (parliamo di 20-24°C). Un laboratorio termostatato che lavori in condizioni ottimali, ovverosia con temperature sotto i 18°C sono poco sopportabili per il personale a meno che le procedure non lo richiedano (es. stabilimenti di lavorazione delle carni: +12°C).
Cosa importante è che tra l'omogenato ed il terreno di inoculo non vi sia una grande differenza di temperatura altrimenti lo shock termico potrebbe uccidere alcuni batteri e se l'inoculo ha un'alta diluizione ci giochiamo il dato.
io le piastre le capovolgo dopo solidificazione e le conserve in frigo
Nella prova specifica sono state in frigo un giorno prima di estrarle e metterle sotto cappa
Quanto tempo devo attendere secondo lei per inoculare?
Quanto tempo consiglia di lasciare l'omogenato nello stomacher? dopo essere processato (1 paio di minuti) mi consiglia di lasciarlo riposare o devo inoculare subito?
Mi consiglia di usare una pistola termica per monitorare la temperatura dell'omogenato e quello della piastra?
Nell'operazione di spatolamento io lascio la piastra sulla cappa e spatolo senza prendere la piastra in mano come insegnavano ai lab di microbiologia non ho acquisito la manualità necessaria? Potrebbe indurre contaminazione ciò?
Le piastre, dopo solidificazione, vanno poste in frigo solo se il terreno è ben asciutto; ma questa tecnica presuppone lo spatolamento non l'inoculo per inclusione, in quanto l'inoculo per inclusione prevede il riponimento in termostato a meno che io non voglia valutare gli psicrofili a +4°C.
Tutto il materiale utilizzato dovrebbe essere termostatato a temperatura ambiente per evitare shock termici anche la soluzione di ringer o l'acqua peptonata non dovrebbe essere fredda da frigo prima della diluizione della matrice alimentare.
Dopo avere omogeneizzato la matrice il tempo massimo per l'inoculo è (nel mio laboratorio operavo al massimo a 15 minuti dalla omogeneizzazione) non superiore a 30 minuti; un'attesa maggiore potrebbe portare ad una prima generazione microbica in sacchetto ( cattività.. :-) ) )
L'omogenato è sempre meglio lasciarlo riposare qualche minuto. Ricorda sempre di dare dei tempi a come operi per rendere il tutto riproducibile.
La pistola termica non sempre è affidabile a meno che tu non l'abbia fatta tarare in un centro SIT.
Come ti dicevo, l'innalzamento termico per massimo 3 minuti di stomaker non genera preoccupazioni; mentre il frullatore si!
La pratica di spatolamento, se ben attuata, non porta alcuna contaminazione: prendere la piastra, sollevare il coperchio spatolare avendo cura di fare tutto questo sotto cappa a flusso laminare di 2° o meglio 3° classe e riporre il coperchio sulla piastra
Lla tua tecnica comunque prevede di girare la piastra in senso orario o antiorario e come lo fai se non con le dita è vero che esistono dei supporti tipo lavorazione della creta ma sono pochissimi i laboratori che li utilizzano.
Ciao, tannico, non preoccuparti.. Se ti sono d'aiuto, ben venga.
Cominciamo coi il Voi, on line la formalità si esplica con il rispetto per cui dammi del tu!!
è sbagliato pensare che i 15 minuti servano per laesciar decantare l'omogenato in quanto se io lascio decantare un omogenato con molta parte solida in sospensione avrò il risultato di trascinamento dei microrganismi verso il basso pertanto quando andrò ad aspirare con la pipetta l'omogenato avrò sicuramente una carica batterica per ml molto inferiore alla reale, lasciare per qualche minuto come sopra detto serve ai batteri per rigenerare possibili danni subiti nel trasporto o da possibili stress a cui sono stati sottoposti durante la preparazione della matrice come cottura o raffreddamento è per questo che l'acqua peptonata è ottima come soluzione per l'omogenato. dopo i 15 minuti io devo agitare il sacchetto es aspirare è chiaro che se ho molto "particolato" in soluzione dovrò utilizzare dei sacchetti per stomaker con rete filtro sul fianco in modo da aspirare solo liquido.
per cortesia non utilizzare mai un accendino la fiamma di un accendino porta a depositare sulla superficie di una bacchetta o di un ago del comburente incombusto con la conseguenza di "avvelenare" l'inoculo, utilizza solo bunsen o bruciatori di ultima generazione elettrici, utilizza solo anse omologate nate per il loro lavoro al massimo bacchette di vetro curvate sulla fiamma del bunsen prima di cominciare a lavorare sotto cappa.
non toccare i bordi serve a no permettere la crescita di colonie in modo allungato o "irrazionale" in teoria se la piastra preparata è sterile i bordi sono sterili, se l'ansa è flambata in modo corretto è sterile per cui la contaminazione è molto remota, non toccare i bordi per non incorrere in forze particolari "coesione dell'inoculo" tra la superficie della piastra ed il suo bordo.
